引言
本標準是為規(guī)范抗菌制品抗菌性能的評價方法制定的，并于1998年12月在“生活相關新型（抗菌）功能制品會議”的報告上公布的，（亦稱“抗菌制品的指導方針”）。本標準規(guī)定了作為抗菌制品重要性能之一的抗菌性能的測試方法?？咕破返钠渌匾阅?，包括安全性、性能持久以及制品標識則請參考“抗菌制品的指導方針”。

1. 范圍
本標準規(guī)定了抗菌制品（包括中間制品）表面抗細菌活性及效果的測試方法。
備注：本標準暫不包括抗菌制品的其他功能，如抗真菌性能和除臭性能。

2. 規(guī)范性引用標準
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是不注日期的引用文件，其新版本適用于本標準。
JIS K 0950 滅菌塑料培養(yǎng)皿
JIS K 0970 微量移液器
JIS K 3800 二級生物安全柜
JIS K 8101 乙醇（99.5）
JIS K 8150 氯化鈉
JIS K 8180 鹽酸
JIS K 8263 瓊脂
JIS K 8576 氫氧化鈉
JIS K 9007 磷酸二氫鉀
JIS K 9017 磷酸氫二鉀
JIS L 1902 紡織品抗菌性能的檢測與評價
JIS R 3505 玻璃量具

3. 定義
本標準中用到的主要術語定義如下：
a）抗菌 抑制制品表面細菌生長的狀態(tài)。
b）抗菌整理 為獲得抗菌效果而進行的處理。
c）抗菌制品 實施抗菌加工后的制品。
d）抗菌活性值 抗菌制品和未處理制品在接種細菌培養(yǎng)后，得到活菌數(shù)目對數(shù)的差值。
參考資料：JIS L 1902的抑菌（靜菌）活性和本標準中的抗菌活性概念相同。
e）抗菌效果 根據(jù)抗菌活性值判定抗菌制品抗菌效果。

4.抗菌效果
按本標準的測試方法，抗菌制品的抗菌活性值應不小于2.0，超過2.0的數(shù)值若取得各相關單位同意也可采用。

5.試驗方法
5.1 紡織制品測試方法  抗菌紡織制品的檢測方法根據(jù)JIS L 1902 : 8（定量法）測定
5.2 塑料等制品的測試方法  適用于非紡織制品，如塑料制品、金屬制品、陶瓷制品等。根據(jù)纖維制品的形狀和用途也可采用5.1 的方法測試。
5.2.1 試驗菌種
試驗所采用的菌種見下，需采用下述細菌中的每一種：
a) 金黃色葡萄球菌
b) 大腸桿菌
試驗所用菌株舉例如表1所示。如從有別于表1的機構獲取菌株，則該機構必須是國際菌種保藏中心（WFCC: World Federation of Culture Collection）的成員或日本菌種保藏協(xié)會（JSCC：Japan  Society of Culture Collection）的成員，并且菌株必須和表1相同。
表1 試驗所用的菌株

5.2.2 化學試劑、材料和器材
除非另有說明，本試驗方法所用的化學試劑、材料和器材如下所示。
乙醇（C2H5OH）   符合JIS K 8012規(guī)定的一級或更高
牛肉膏           微生物試驗用
蛋白胨           微生物試驗用
氯化鈉           符合JIS K 8150
純化水           符合日本藥典第十三次修訂版要求
瓊脂             符合JIS K 8263
酵母浸膏         微生物試驗用
胰蛋白胨         微生物試驗用
葡萄糖           微生物試驗用
酪蛋白胨         微生物試驗用
大豆蛋白胨       微生物試驗用
卵磷脂           微生物試驗用
非離子表面活性劑 聚山梨醇脂（吐溫80）
磷酸二氫鉀       符合JIS K 9007
磷酸氫二鉀       符合JIS K 9017
氫氧化鈉         符合JIS K 8576
鹽酸             符合JIS K 8180
棉塞等           棉制，或硅膠、金屬、莫頓塞等
白金接種環(huán)       端部直徑約為4mm環(huán)
干熱滅菌器       可在160-180℃工作
蒸氣消毒鍋       可保持121℃并在103KMPa保壓
安全柜           符合JIS K 3800的規(guī)定
潔凈臺           微生物試驗用
移液管           符合或等同于JIS K 0970 或達到JIS R 3505中規(guī)定的A級
培養(yǎng)箱           溫度控制精度±1℃
培養(yǎng)皿           玻璃材質(zhì)，內(nèi)直徑90mm或遵照JIS K 0950中90A或90B規(guī)定
洗脫袋           微生物試驗用
Stomacher         微生物試驗用
薄膜             不影響微生物生長并且不吸水的材料，厚度無明確規(guī)定，但要求附著性好

5.2.3 滅菌方法
a) 干熱滅菌   放入干熱滅菌器在160-180℃下滅菌30-60分鐘
注意：滅菌后，如果棉塞或包裝紙不小心被水弄濕，相關器皿請不要繼續(xù)使用。
b) 高壓蒸汽滅菌  在滅菌消毒鍋中注入水，將待滅菌的物品裝入筐中，并放于消毒鍋架子上，蓋緊，加熱，在121℃或103Kpa下保持15-20分鐘。停止加熱，然后使其自然冷卻到100℃以下，打開排氣閥放出蒸汽，打開蓋，取出滅菌物品。必要時放入潔凈臺或安全柜中冷卻。為避免滅菌鍋受培養(yǎng)物質(zhì)或化學品污染，用中性洗滌劑洗滌滅菌鍋，并用水沖洗干凈。
c) 火焰滅菌 將待滅菌的物品置于由燃氣或酒精燃燒而產(chǎn)生的火焰上，如對于白金接種環(huán)應加至紅熱，對于試管則在火焰上烤2-3秒鐘。
d) 器材準備 用堿性或中性洗滌劑洗刷試管、燒瓶等器具，充分沖洗，干燥后干熱滅菌或蒸汽滅菌后使用。

5.2.4 培養(yǎng)基等
使用下列培養(yǎng)基，如商品培養(yǎng)基和此處介紹的培養(yǎng)基組成相同，則也可使用商品培養(yǎng)基。
a）營養(yǎng)肉湯  將3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化鈉溶于1000ml蒸餾水或去離子水中，放入錐瓶、混合、充分溶解后，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為7.0-7.2（25℃），使用前，將其分別注入試管，加上棉塞，然后進行高壓滅菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養(yǎng)基。
b）營養(yǎng)瓊脂  將5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化鈉和15.0g瓊脂，加入1000ml蒸餾水或去離子水中，置入錐瓶、混合并放入沸水浴中充分溶解。用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為7.0-7.2（25℃），加上棉塞，然后進行高壓滅菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養(yǎng)基。
c）平板計數(shù)瓊脂  將2.5g酵母粉、5.0g胰蛋白胨、1.0g葡萄糖和15g瓊脂加入到1000ml蒸餾水或去離子水中，置于錐瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2（25℃），加上棉塞，然后進行高壓滅菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養(yǎng)基。
d）斜面培養(yǎng)基  將6-10ml加熱溶解的營養(yǎng)瓊脂b)注入試管，塞上棉塞并用高壓蒸汽法滅菌。滅菌后的試管在潔凈間中以和水平面成15°傾角放置來讓其凝固。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。如沒有冷凝水出現(xiàn)，將其溶解，并凝固后使用。不要使用配制完存放一個月或以上的斜面培養(yǎng)基。
e）SCDLP肉湯  將17.0g酪蛋白胨、3.0g大豆蛋白胨、5.0g氯化鈉和2.5g磷酸氫二鈉、2.5g葡萄糖和1.0g卵磷脂加入到1000ml蒸餾水或去離子水中，置于燒瓶，加7.0g非離子表面活性劑以促進溶解。用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為6.8-7.2（25℃）.使用此培養(yǎng)基時，將其分散到試管中或燒瓶中，將棉塞塞上，然后用高壓濕熱法滅菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的SCDLP肉湯。
f）磷酸鹽緩沖溶液  將34.0g磷酸二氫鉀放入容量瓶中，加入500ml蒸餾水或去離子水已將其充分溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為6.8-7.2(25℃),然后加入蒸餾水或去離子水將溶液定容到1000ml。使用時，取部分溶液到試管或燒瓶中，塞上棉塞，并加入7.0g非離子表面活性劑。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為6.8-7.2（25℃）。使用此溶液時，將其分裝至試管或燒瓶中，塞上棉塞，然后用高壓濕熱法滅菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的磷酸鹽緩沖溶液。
g）磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液
用濃度為0.85%的氯化鈉溶液稀釋磷酸鹽緩沖溶液至體積比800倍。當使用此溶液時將其分裝至試管或燒瓶中，塞上棉塞，然后用高壓濕熱法滅菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液。

5.2.5 細菌的保藏 在無菌條件下轉(zhuǎn)接試驗細菌，必要時要使用生物安全柜。一手同時拿著保藏菌和5.2.4 d)的待接種斜面培養(yǎng)基，另一手拿接種環(huán)，并用拿接種環(huán)的手拔開試管的橡膠塞。在火焰上對試管口滅菌，并對接種環(huán)滅菌，然后將接種環(huán)的頭部放入斜面培養(yǎng)基的冷凝水中冷卻。用接種環(huán)從細菌生長面上刮下細菌，并用劃線法接種到斜面培養(yǎng)基上。用火焰再次對試管口部進行消毒并塞上棉塞。用火焰對接種環(huán)進行消毒。在35±1℃下對接種后的斜面進行24-48小時培養(yǎng)，然后在5-10℃保藏。一個月內(nèi)將其接種到新的斜面（以此類推），但接種次數(shù)從菌種中心得到的細菌算起不應超過10代。如保存時間達到或超過一個月，不可進行繼代培養(yǎng)。

備注：如圖1將接種環(huán)端部插入冷凝水中分散細菌，用接種環(huán)從底部拉一條線到上部，或?qū)⒔臃N環(huán)再次插入到冷凝水中畫一條折線到頂端。
注意：如細菌保藏機關提供的細菌經(jīng)過凍干法或冷凍法用于長時間保存，從原始保存菌制備保藏細菌的次數(shù)也應包括在細菌培養(yǎng)代數(shù)之內(nèi)。
如使用此保藏菌株，則其繼代培養(yǎng)次數(shù)不應超過10減去保藏菌的代數(shù)。

5.2.6 試驗操作 細菌操作必須在無菌條件下進行，試驗菌注意不能對試驗操作人員、設備和環(huán)境構成污染，如有需要則使用生物安全柜。
a）細菌前培養(yǎng) 用接種環(huán)從5.2.5的保藏細菌的培養(yǎng)基中取1環(huán)細菌接種到5.2. 4 d)的斜面培養(yǎng)基上，35±1℃條件下培養(yǎng)16-24小時。從這一培養(yǎng)物上，再取一環(huán)細菌到新的斜面培養(yǎng)基上，35±1℃條件下培養(yǎng)16-20小時。
b）樣片準備 從制品上切取邊長為50±2mm，厚度不大于10mm[3]的方塊，作為標準樣片?？瞻讓φ諛覽4]6塊[5]、抗菌樣片3塊。如不能得到空白對照樣，則利用5.2.2的薄膜。密切注意樣片和樣片制備過程中的微生物污染以及制品的污物污染。盡量從制品上采集樣片，如由于制品的形狀的原因不能從制品采集樣片，則利用相同的原料和工藝單獨制備樣片。
備注：
[3]如難以或不能將制品切成50±2mm，厚度不大于10mm的方塊，也可采用非標準形狀和尺寸的樣片，這一樣片應該可以在其上覆蓋400-1600mm2的薄膜。
[4]從空白樣或薄膜制得的樣片。
[5]6個未抗菌處理樣片中，3個用于接種后零時間記數(shù)，另外3個用于接種后培養(yǎng)24小時后記數(shù)。
c）樣片清洗 用紗布或脫脂棉蘸酒精輕輕擦拭b)中樣片2-3次，并干燥徹底。若上述處理會導致樣片軟化、樣片表面涂層溶解及組分溶出等現(xiàn)象，則認為此種處理將影響試驗結果，可采用其他方法處理或直接試驗而不進行任何處理。
d）接種菌液的制備  將5.2.4 a）的營養(yǎng)肉湯稀釋500倍，用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.8-7.2,然后高壓滅菌，作為1/500NB。將a)中的前培養(yǎng)物取1環(huán)均勻分散到少量的1/500NB中，采用顯微鏡觀察法或其它合適的方法估計細菌數(shù)目，并用1/500NB稀釋菌液至細菌濃度為(2.5～10)×105cfu/ml,以此作為試驗用菌液。若菌液不立即使用，將其冷凍至0℃，保存時間不超過4小時。
e）試驗菌液的接種 將c)中的樣片放入滅菌培養(yǎng)皿中，保持試驗面朝上[6] ，用移液管[7] 準確量取d）中的菌液0.4ml,緩慢滴到每個樣片表面。并將薄膜蓋于菌液上，調(diào)節(jié)薄膜使菌液分散到整個薄膜，注意不要使菌液從薄膜邊溢出，然后蓋上培養(yǎng)皿的上蓋。
備注：
[6] 試驗面必須為制品的抗菌加工面，即使抗菌加工達到制品的一定深度，也不能采用制品的橫切面。
[7] 若采用標準尺寸以外的樣片，則所加菌液量根據(jù)該樣片所用薄膜的尺寸按比例減少。即使對于符合標準尺寸的樣片，如按規(guī)定量接種時，由于某些材料如陶瓷、玻璃、瓷磚、搪瓷等的親水性好，難免因培養(yǎng)皿稍微傾斜而導致培養(yǎng)液流出。此種情況下，接種菌液量減為規(guī)定菌液量的1/4。但即使菌液量減少也要保證每片上的細菌數(shù)為（1.0-4.0）×105cfu/ml，此種情況下，d)中規(guī)定的菌液濃度不能滿足要求，而必須根據(jù)具體要求配制。
[8]薄膜的標準尺寸為40±2mm。若樣片為非標準尺寸，則調(diào)整薄膜尺寸，以使薄膜邊緣距樣片邊緣2.5mm以上，但薄膜尺寸不應小于400mm2。在制品由于形狀難以將薄膜密著于樣片表面，以及由于表面吸水或親水，不使用薄膜菌液也可在樣片表面鋪展這二種情況下可不用薄膜。
f）接種后樣片的培養(yǎng) 將接種后放置3個抗菌樣片和3個空白無加工樣片的培養(yǎng)皿，在35±1℃相對濕度不小于90%的條件下培養(yǎng)24小時。
參考資料：此時制品的抗菌性能是在該培養(yǎng)溫度下的抗菌活性值，但也可同時考慮抗菌材料的使用溫度（如室溫）下的抗菌性能。
g）培養(yǎng)后樣片的洗脫
1）0接觸時間的樣片的洗脫[9] 對3個0接觸時間的空白對照樣，將覆蓋膜和樣片用鑷子小心放入Stomacher袋以防止菌液損失，用移液管取5.2.4 e)中10ml SCDLP加入到Stomacher袋中，并用手或分離器充分搓揉樣片和薄膜。洗脫后馬上對洗脫液進行活菌計數(shù)。
2）培養(yǎng)后試驗片的洗脫[9]   對f）中的培養(yǎng)后樣片的洗脫采用類似1）的方法進行，之后馬上對洗脫液進行活菌計數(shù)。
[9] 對于細菌洗脫，如有其他方法效果與此種方法相當或優(yōu)于此方法，也可采用。如因為樣片尺寸以及其他性能方面的原因，用10ml SCDLP難以洗脫，也可增加SCDLP用量。
h）傾注活菌計數(shù)法 用移液管準確量取g)的洗脫液1ml，放于裝有9.0ml 5.2.4  g)中的磷酸鹽生理鹽水緩沖液的試管中，充分混勻。用新的移液管從中量取1ml到另一支試管中并混勻。重復上述10倍梯度稀釋過程。從洗脫液及其稀釋液中分別取1ml，各放入2個滅菌培養(yǎng)皿中，向各培養(yǎng)皿中傾入15-20ml溫度為46-48℃的5.2.4 c)中的平板計數(shù)瓊脂，與菌液混和充分。蓋上上蓋，允許在室溫放置。待瓊脂凝固后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，并在35±1℃培養(yǎng)40-48小時。培養(yǎng)后，計算菌落數(shù)為30-300的培養(yǎng)皿，若1ml洗脫液中的細菌數(shù)小于30，則對該培養(yǎng)皿直接計數(shù)。如任何培養(yǎng)皿中均沒有菌落，則記錄為＜1。如果細菌數(shù)和稀釋比例不成反比，則要考慮由于抗菌劑的作用而影響了菌落的形成，這樣就需要使用中和劑或稀釋等方法使抗菌劑不對菌落形成產(chǎn)生影響的方法來培養(yǎng)計數(shù)。
參考資料：本規(guī)定以外采集的菌落數(shù)的計算方法，可參考日本藥學會編的衛(wèi)生試驗法注解（2000）1.2微生物試驗法3）菌數(shù)測定（1）傾注平板試驗法，或衛(wèi)生福利部生活衛(wèi)生局監(jiān)制修訂的食品安全規(guī)則的2有害指示菌1.標準分析方法中的總菌數(shù)測定。

5.2.7  活菌數(shù)計算
根據(jù)式（1），由菌落計數(shù)的得到活菌數(shù)。
N=C×D×V                                                           （1）
其中  N:每樣片的活菌數(shù)
C:菌落數(shù)（2個培養(yǎng)皿的平均值）
D:稀釋倍數(shù)
V：用于洗脫的SCDLP培養(yǎng)液的體積(ml)
記錄活菌數(shù)時取二位有效數(shù)字，第三位有效數(shù)字四舍五入。在V=10的情況下，對菌落數(shù)小于1的情況記為小于10。取活菌數(shù)的平均值時，對三個試驗片的活菌數(shù)取算術平均值，結果保留二位有效數(shù)字，第三位有效數(shù)字四舍五入。當活菌數(shù)為小于10時，此數(shù)作為10 進行平均值計算。

5.2.8 試驗結果
a）試驗成立條件的判定  當下述三個條件都得到滿足時，試驗被判定有效。反之，則試驗無效，須重新進行試驗。

1. 空白對照樣片零接觸時間的活菌數(shù)滿足如下條件：

（L最大- L最小）/ L平均≤0.2
其中：L最大—活菌數(shù)的最大對數(shù)值
L最大—活菌數(shù)的最小對數(shù)值
L平均—三個樣片的活菌數(shù)對數(shù)的平均值

1. 零接觸時間空白對照樣的活菌平均值應為(1.0-4.0)×105個。

2. 三個空白對照樣經(jīng)24小時培養(yǎng)后的活菌數(shù)均不能小于1.0×103個。當空白對照樣上覆蓋薄膜時，三個樣品培養(yǎng)后的活菌數(shù)均不能小于1.0×104個。

b）抗菌活性值計算  試驗成立條件下，根據(jù)式（2）計算抗菌活性值，保留小數(shù)點后一位有效數(shù)字，對小數(shù)點后的第二位有效數(shù)字四舍五入。
R=[log(B/A)- log(C/A)]=  [log(B/C)]                                        (2)
其中： R-抗菌活性值

1. 空白對照樣0接觸時間活菌數(shù)平均值

2. 空白對照樣24小時培養(yǎng)后活菌數(shù)平均值

3. 抗菌加工樣片24小時培養(yǎng)后活菌數(shù)平均值

6  試驗結果記錄
6.1 紡織制品  記錄試驗細菌種類、細菌保藏號、接種菌液濃度（接種菌液中所含的細菌數(shù)）、抗菌活性（抑菌活性）、樣片種類等。如在接種液中加入了非離子表面活性劑，則須記錄其名稱和濃度。
6.2 塑料制品  記錄空白對照和抗菌處理樣片的種類、尺寸、形狀、厚度、薄膜厚度、細菌種類、保藏號、接種用菌液的體積、試驗菌液中的活菌數(shù)、5.2.8中的A、B、C值以及抗菌活性值等。